一、收到原代培养的细胞后应该有哪些注意事项？

显微镜下观察细胞状态，看是否有细胞脱落、漏液和污染等异常情况，然后仔细阅读产品说明书，因不同品牌、不同种属、不同类型的细胞其培养技巧存在些许差别，户收到细胞后，请务必仔细阅读随货附赠的说明书，切记不可仅凭经验操作。

通常，我们可以从说明书中获取以下重要信息：

（1）细胞数目

（2）细胞增殖能力

（3）推荐培养基、培养器皿及包被液

（4）推荐接种密度

（5）复苏、培养、传代等操作步骤

（6）运输、储存及培养条件

二、细胞培养操作说明

收货处理

1. 贴壁细胞

发货形式：T25方瓶、冻存管

1. 1) 收到T25方瓶细胞后，拆开T25方瓶的自封袋，不拆封口膜，表面喷75%酒精后请在显微镜下确认细胞生长状态（可以拍下此时细胞照片）。去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养箱中约2-3h，然后再处理细胞。首先将T25方瓶中的培养基取出装在两个50ml离心管中备用，然后消化传代。检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们（冻存管细胞收到后直接37℃水浴复苏或直接放置于液氮中长期储存）。

2. 2) 冻存管细胞，收到细胞后按照细胞复苏的步骤操作即可。

2、悬浮细胞

收到细胞后，请检查是否漏液，如果漏液，请拍照片发给我们。请先在显微镜下确认细胞生长状态，去掉封口膜并将细胞置于中37培养箱℃平衡约2-3h。然后，1200rpm离心5min，弃去15ml离心管中的培养基，细胞沉淀用新鲜的完全培养基重悬并培养。

细胞的培养及传代

1、细胞培养

正确的培养基90%；优质胎牛血清10%。

培养条件： 温度37℃，CO2，5%。，培养箱湿度为70%-80%。极少部分细胞培养条件不一致，请仔细阅读对应的细胞说明书，使用正确的培养方式。

冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。

2、细胞传代

如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代。

1.  贴壁细胞的传代

（1） 弃去培养瓶中的培养基，用不含钙、镁离子的PBS浸洗皿/瓶底所有部位的细胞1-2次。

（2） 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，轻轻晃动培养瓶，置于37℃培养箱中消化2-3分钟。

（3） 2-3分钟后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。若细胞仍在贴壁，放回培养箱中继续消化至细胞大部分变圆脱落为止。

（4） 轻轻吹打培养瓶底，然后将瓶中的培养基吸出，移入15ml离心管中，在1200RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。

（5） 均分到几个到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中，放回培养箱培养。

细胞冻存

细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-4步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。

细胞复苏：

1）将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻融化。

2）移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基重悬细胞。

3）将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中入培养箱培养。第二天换液并检查细胞密度。

三、原代细胞的传代周期和传代次数怎样确定？

原代细胞一般是采用“倍增次数”来描述细胞生长潜能的，一次细胞倍增是指细胞总数增长为原来的2倍，一次传代通常是指将一瓶细胞扩增至2-3瓶。由于不同物种、组织来源、细胞类型和体外培养条件等因素的影响，原代细胞“倍增次数”可能会有很大差异，所以对某些原代细胞的传代周期和传代次数需进行具体分析。

四、欣润生物的原代细胞，是否需要特定的包被液包被培养瓶/皿？

欣润生物的大多数细胞可以在不使用包被液的情况下自行贴壁。然而仍有部分细胞类型需要使用指定的包被材料。具体情况请参见说明书中相应部分的内容。

五、如何计算大鼠胰岛的IEQ值？

一般情况下,直径大小为150um 的胰岛细胞 = 1 IEQ.

胰岛 IEQ 对照表：

显微镜下记录细胞大小和数量后，请按以上对照表计算，再乘以稀释倍数就是总的IEQ值。

例如：您从3ml细胞悬液中取出50ul，观察计数后得出：

        50-100 um 有5个胰岛

        101-150 um 有3个胰岛

        151-200 um 有2个胰岛

        201-250 um 有4个胰岛

那么总的IEQ值=60×（0.17×5+0.67×3+1.7×2+3.5×4）=1215.6 IEQ